Идентификация ин витро клеток опухолей человека и животных, перевивамых культур, трихомонад и лимфоцитоподобных клеток крови

Заведующий лаборатории д.б.н., профессор N.

Ответственный исполнитель — автор заявки на открытие паразитарной (трихомонадной) этиологии рака НК 427 Т. Я. Свищёва

Исполнители:

К. б. н., ст. н. с. Т. В. Г.

К. в. н., ст. н. с. И. А. Я

К. б. н., н. с. Д. Е. А.

(По просьбе профессора, высказанной еще в 1994 г., название НИИ и лаборатории, а также фамилии его и других исполнителей не указываю. Эксперименты проводились при спонсорском субсидировании — Т.Я.С).

г. Москва, 1995 г.

РЕФЕРАТ

Данная научно-исследовательская работа, направленная на изучение проблемы рака, как и предыдущая, была профинансирована одним из московских спонсоров, с которым мне удалось договориться. Целью планируемых экспериментов было еще раз доказать паразитарную природу опухолевых клеток путем идентификации их с клетками перевиваемых культур, трихомонадами и атипическими клетками крови, принимаемыми гематологами за лимфоциты. Для этого были проведены сравнительные морфологические исследования клеток в процессе их культивирования в питательной среде для трихомонад, а также оказывались воздействия физико-химическими факторами, которые считаются летальными для нормальных клеток. Изучались причины и характер гибели исследуемых клеточных культур.

Как оказалось в дальнейшем, данные научные эксперименты, проведенные на клеточном уровне, показали морфологическое (при наличии большого полиморфизма) и физиологическое сходство исследуемых культур. Анализ отпечатков органов и препаратов крови животных, а также препаратов венозной и периферической крови человека, содержимого десенных карманов стоматологических больных и соскобов из половых органов пациенток гинекологического кабинета показали во всех случаях наличие трихомонад, преимущественно в цистоподобной и амебовидной стадиях существования.

Обнаружение большего числа трихомонад в устойчивой форме — в виде округлых неподвижных клеток объясняется не только воздействием иммунитета, но и, главное, — подавляющим влиянием на них обильной и разнообразной микрофлоры. Исследование опухолевых и перевиваемых клеточных культур, полученных в институтах РАН, РАМН и Минздрава РФ, также показало, что они изначально были контаминированы грибами и бактериями. Все это осложняло проведение намеченных экспериментов.

ВВЕДЕНИЕ

Целью данной научно-экспериментальной работы является доказательство паразитарной природы опухолевых клеток и клеток перевиваемых культур. Для этого планировалось осуществить следующее:

- В питательные среды для культуральной диагностики трихомонад посеять суспензии перевиваемых клеток типа ВНК-21 и СПЭВ, а также опухолевых клеток. Изучить морфологические изменения клеток и характер развития клеточных культур в этой среде (на стеклянных подложках и в суспензии).

- Трихомонады засеять в питательные среды для культуральной диагностики трихомонад и в питательную среду Игла, с добавлением сыворотки крови лошади и антибиотиков. Провести последовательные пассажи с целью накопления биомассы трихомонад и выявления амебовидных и цистоподобных форм клеток. При пересевах готовить препараты: нативные и окрашенные по Романовскому на предметных стеклах.

- На клеточные монослои перевиваемых культур во флаконах ввести суспензию трихомонад для последующего изучения их развития в ассоциации с клетками СПЭВ и ВНК-21, а также с опухолевыми клетками.

- Высеять в отдельные флаконы опухолевые клетки и перевиваемые клеточные культуры для получения контрольных препаратов «нормального» клеточного роста.

Как показало дальнейшее, уже на первых этапах исследования было обнаружено: исходные клеточные культуры, сыворотка крови и исходные компоненты для приготовления питательных сред контаминированы грибами и бактериями. Этот печальный факт заставил изменить и значительно расширить зону исследований.

Объекты исследования

1. Перевиваемые клеточные культуры:

- СПЭВ — свиная почка, эмбриональная, версенизированная;

- УЕРО — почка зеленой мартышки;

- почка обезьяны № 4647;

- почка обезьяны СУ-1;

- почка эмбриона сайги;

- ППС — перевиваемая почка свиньи.

2. Культуры опухолевых клеток:

- карцинома шейки матки Hela — два музейных штамма;

- рак гортани человека;

- миома от оперированной женщины в госпитале им. Бурденко;

- миома от оперированной женщины 55 лет в московской городской больнице № 15;

- перевиваемая опухоль мыши П 815;

- перевиваемая асцитная опухоль мыши МХ-11.

3. Лимфоидные клетки МТ-4 (Япония).

4. Трихомонады человека:

- ротовая и вагинальная трихомонады от пациентов МСЧ, г. Москва;

- кишечная трихомонада — лабораторный штамм из Института паразитологии и тропической медицины им. Марциновского.

5. Венозная и периферическая кровь от группы практически здоровых людей.

6. Органы двухнедельного эмбриона крольчихи.

ХОД И ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТОВ

1. Для проведения исследований были приготовлены питательные среды Джонсона — Трасселя для культуральной диагностики трихомонад: с 1% агар-агара, с 0,1% агар-агара и без агар-агара. Ввиду отсутствия чистых (аксенических, или неконтаминированных) культур перевиваемых клеток, для исследования были использованы другие материалы: препараты крови человека и органы животных. Клетки мозга, легкого, печени и кишечника двухнедельного эмбриона крольчихи были трипсинизированы и пересеяны в питательную среду № 199 с добавлением 10%-ной сыворотки крови крупного рогатого скота, предварительно инактивированной. Из взвешенных над монослоем клеток были приготовлены фиксированные окрашенные препараты. Просмотр их под микроскопом показал наличие овальных и округлых клеток размером от 4 до 9 мкм. Часть клеток была вакуолизирована. При последующих пересевах культуры проросли грибами и погибли.

Исследовалась периферическая кровь из безымянного пальца руки, взятая у пяти женщин в возрасте от 35 до 57 лет. В препаратах крови, фиксированных спиртом и окрашенных по Романовскому, наряду с красными клетками эритроцитов и узнаваемыми ядерными лейкоцитами были обнаружены сине-фиолетовые клетки, похожие на лимфоциты. Однако лимфоциты имеют размеры от 8 до 15 мкм и представляют собой крупное округлое ядро, окруженное тонким пояском цитоплазмы, окрашивающимся в синий цвет. А обнаруженные клетки были похожи на округлые и овальные ядра, без цитоплазмы, или имели небольшие ее участки различной конфигурации, окрашенные в голубоватый цвет. Размеры этих клеток были небольшие, от 5,5 до 8 мкм. Была осуществлена попытка инкубации крови человека в питательной среде для трихомонад с целью осуществления перевода цистоподобных форм в узнаваемые амебовидные и жгутиковые. Для активизации трихомонад вводилась желчь крупного рогатого скота (коров), привезенная мною с московского мясокомбината. Но культуры проросли грибами и стали непригодными для эксперимента.

После неудачного опыта были проверены на контаминацию: питательные среды, сыворотка крупного рогатого скота и желчь — везде обнаружено наличие грибов. Работа была приостановлена, бокс обработан парами формалина. Пробирки, в которых хранилась питательная среда, были повторно автоклавированы.

Растворы пенициллина, стрептомицина и трипсина, приготовленные на питательной среде, были уничтожены. Получен новый флакон сыворотки крови крупного рогатого скота, которую инактивировали при температуре 56 °С в течение 30 минут. На ее основе были разведены антибиотики, в том числе противогрибковый амфотерицин.

В новый эксперимент были взяты: миома матки от оперированной женщины в госпитале им. Н. Н. Бурденко, перевиваемые культуры СПЭВ и ППС, музейный штамм карциномы шейки матки Hela. В процессе исследований было сделано несколько пересевов, изготавливались окрашенные препараты на стеклянных подложках. Для стимуляции роста клеток были введены специально приготовленные факторы роста: гормон фолликулин, аскорбиновая кислота, глюкоза. Инкубация культур проводилась в питательных средах с агар-агаром, без агар-агара и с введением антибиотиков. В качестве контроля параллельно проводилось культивирование опухолевых клеток Hela в среде № 199 в виде монослоя, с добавлением 10%-ной сыворотки крупного рогатого скота (КРС). Через два пересева культуры проросли грибами и погибли. То же произошло и с контролем, но несколько позднее (см. табл. 1).

Своеобразен характер изменений опухолевых и перевиваемых клеток. В монослое на стекле это крупные полиморфные клетки (с 1–3 ядрами, окруженные, по мнению Свищёвой, разуплотненной протоплазмой или цитоплазмой). Над монослоем, во взвешенном состоянии, это округлые безъядерные особи, похожие на крупные ядра. При пересеве в питательную среду для культуральной диагностики трихомонад клетки не гибли, не лизировались, как это должно происходить с нормальными клетками (им присущ аутолиз), но при этом клетки как бы уплотнялись, становились меньше. Когда культуры начали прорастать сопутствующей микрофлорой, клетки не лизировались, а распадались на мелкие частицы в виде гранул, что присуще трихомонадам (табл. 1).

После гибели и этих культур на кантаминацию микрофлорой были проверены все имевшиеся в лаборатории компоненты, из которых готовилась питательная среда для культуральной диагностики трихомонад: пептон, дрожжевой экстракт, мальтоза, солянокислый цистеин. Везде были обнаружены грибы кандида или кандида-крузеи.

2. На предприятиях-изготовителях и в аптечных складах Свищёвой были приобретены (на спонсорские деньги, которым велся строгий учет для ежемесячного отчета перед спонсором) новые составляющие для питательных сред, а на московском мясокомбинате — новая партия сыворотки крупного рогатого скота и свежая печень. Затем была приготовлена новая питательная среда для культуральной диагностики трихомонад, и сыворотка крови проверена на контаминацию.

В двух научно-исследовательских институтах г. Москвы были получены лимфоидные клетки (Япония) и штамм злокачественной опухоли гортани человека. При пересеве в питательную среду для культуральной диагностики трихомонад вновь произошел пророст культуры опухолевых клеток грибами. Клетки «погибали» путем грануляции и распада на мелкие частицы в виде гранул (это один из способов сохранения своего вида, который присущ трихомонадам). Когда специалисты НИИ, занимающиеся культурой рака гортани, были поставлены в известность о гибели клеток, они признали возможность контаминации их грибами и согласились предоставить новый образец культуры.

Параллельно с данными экспериментами в этот период времени проводились также сравнительные исследования перевиваемых клеток почки сайги, культивируемых как в обогащенной среде ФГМС, так и в среде для культуральной диагностики трихомонад. В обоих случаях произошел пророст культур микрофлорой, грануляция клеток на мелкие округлые частицы в виде гранул.

В медсанчасти № 12 от четырех стоматологических больных заведующей стоматологическим отделением В. Д. Гончаровой было отобрано содержимое десенных карманов и помещено в стерильные пробирки с питательной средой для трихомонад, привезенных Свищёвой. Одновременно от четырех пациенток в возрасте от 20 до 43 лет заведующей стоматологическим отделением Кацеповой были взяты мазки из цервикального канала и влагалища и также помещены в стерильные пробирки. Все пробы изобиловали гигантскими эпителиальными клетками, грибами и бактериями, что пагубно влияло на состояние ротовых и вагинальных трихомонад: они были преимущественно в цистоподобной стадии существования (в стадии покоя), а амебовидные формы клеток были вакуолизированы. В процессе инкубации ротовых и вагинальных в питательной среде для культуральной диагностики трихомонад произошел пророст их грибами и бактериями, несмотря на наличие антибиотиков. Чистые культуры трихомонад не удалось получить, даже применяя такие антибиотики, как амфотерицин и гентамицин, так как скорость размножения микрофлоры в 5–6 раз выше, чем у простейших. Трихомонады, погибая, также гранулировались до мелких частиц в виде гранул (табл. 2).

Повторно в НИИ были получены культуры клеток злокачественного рака горла человека. Предварительный просмотр штамма под микроскопом показал сплошной монослой на стенке флакона и бурный рост округлых клеток в надосадочной среде. Часть этой культуры была пересеяна в питательную среду для культуральной диагностики трихомонад. Затем изготовлены окрашенные препараты на стеклянных подложках. Их микроскопический анализ показал в обоих случаях наличие округлых, ядерных и безъядерных клеток, в том числе гранулированных до мелких частиц, и снова — грибы. Через 48 часов инкубации в надосадочной жидкости преобладали грибы и полуразрушенные или разрушенные до гранул клетки. В данном случае причиной пророста опухолевых клеток могла быть только изначальная контаминация клеточной культуры. При обсуждении факта пророста штамма со специалистами НИИ, любезно предоставившими свой штамм злокачественного рака горла человека, они сообщили, что не добиваются стерильности культуры, поскольку данные клетки используются ими лишь в качестве субстрата для размножения различных вирусов, которые, как известно, считаются внутриклеточными паразитами. В результате термостат пришлось отключить, он был прожжен факельным огнем, бокс обеззаражен формалином.

3. Приготовлена новая питательная среда, разлита по пробиркам и повторно автоклавирована. Приобретена эмбриональная сыворотка крови (изготовитель Казанский университет). В Институте микробиологии получены культуры почки обезьяны и в Институте паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского — кишечная трихомонада, культивируемая в среде Павлова (рисовая мука на буферном солевом растворе). Культура трихомонады была поликсеничной, то есть зараженной различной микрофлорой. Кроме того, были получены: перевиваемая культура почки сайги и новый музейный штамм карциномы шейки матки Hela (штамм в запаянной пробирке был привезен зав. лабораторией из Института цитологии РАН г. Санкт-Петербурга). Все эти клеточные штаммы инкубировались как в исходных средах, так и в питательной среде для культуральной диагностики трихомонад, с добавлением антибиотиков: бензилпенициллина, стрептомицина и амфотерицина. Культуры пересевались и изучались как в нативных, так и фиксированных препаратах. Но все они, будучи изначально контаминированными сопутствующей микрофлорой, вновь проросли грибами и погибли. (Здесь хотелось бы отметить следующее. В 1995 г. в Москве я хотела повторить те эксперименты на клеточном уровне, которые были более успешно проведены мною в 1990–1991 гг. в НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта г. Ленинграда. Тогда мне тоже приходилось получать штаммы опухолевых клеток в Институте цитологии РАН. Это были монослои из одинаковых клеток на стенках флаконов, что подтверждало их стерильность. Если же в монослое появлялись полигональные клетки, сотрудник лаборатории сразу же предупреждала, что штамм нестерилен. Тем не менее для пробы я взяла и такой флакон и вскоре увидела, что культура проросла примерно так же, как это регулярно стало происходить в 1995 г. Поэтому даже запаянная пробирка со штаммом карциномы шейки матки Hela не гарантировала ее стерильность — никто не видел, каким по качеству был монослой. — Т. Я. С.)

АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

В процессе проведенных исследований было осуществлено 300 пересевов культур трихомонад, опухолевых и перевиваемых клеток. Еще больше было изготовлено окрашенных препаратов этих клеток, которые затем были просмотрены под микроскопом, описаны и частично сфотографированы.

1. Основным препятствием в качественном проведении экспериментов было отсутствие стерильности исходных штаммов клеток и некоторых компонентов, из которых готовились питательные среды. Культуральный и электронно-микроскопический анализ показал:

- все штаммы тканей эмбриона человека, перевиваемых и опухолевых клеток, полученные в научно-исследовательских институтах АН, АМН, Минздрава РФ, были контаминированы вирусами, грибами и бактериями, а в одной из опухолей мыши обнаружена спиралевидная филярия;

- все компоненты, из которых готовились питательные среды в начале эксперимента, были заражены грибами кандида и кандида-крузеи;

- сыворотки крови крупного рогатого скота из двух партий, изготовленных на московском мясокомбинате, оказались контаминированы грибами;

- эмбриональная сыворотка, изготовленная в Казанском университете, обладала токсичностью;

- ротовая и вагинальная трихомонады, полученные от пациентов в возрасте от 16 до 82 лет, были во множестве контаминированы различными бактериями и грибами.

2. Вследствие более быстрого размножения бактерий и грибов по сравнению с трихомонадами и опухолевыми клетками, клеточные культуры прорастали сопутствующей микрофлорой и погибали. Этому также способствовало обогащение питательной среды для культуральной диагностики печеночным и дрожжевым экстрактами и факторами роста: гормоном фолликулином, инсулином, глюкозой, аскорбиновой кислотой, — а также инактивация сыворотки (с целью нейтрализации антител), трепсинизация клеток 0,125–0,25%-ным раствором протеолитического фермента трипсина и облучение их летальными дозами рентгеновских лучей — 700 и 600 рад.

3. Сохранение в питательных средах даже после автоклавирования жизнеспособных грибковых спор и токсинов, а в клеточных штаммах — микрофлоры, которая не подавлялась даже антибиотиками, препятствовало идентичному повторению ранее проведенных в 1990–1991 гг. экспериментов, в результате которых был осуществлен параллельный перевод округлых трихомонад и опухолевых клеток в узнаваемые амебовидные и жгутиковые формы.

4. Попытка получить от онкологов разные виды опухолей от оперированных людей оказалась неудачной: трижды хирурги давали кусочки хрящевидной миомы матки, трудно поддающейся даже скальпелю, не говоря о культивировании. (Образование твердой, хрящевидной опухоли в мягких тканях матки необъяснимо с позиции клеточных теорий, выдвинутых онкологами. Однако с позиции трихомонадной природы опухолевых клеток все легко объясняется: именно жгутиконосцам, в данном случае трихомонадам, присуще свойство выделять роговое вещество или студенистое — отсюда возникают ороговевающие или асцитные опухоли. — Т. Я. С.)

5. Проведенные обследования людей на ротовую и вагинальную трихомонаду показали наличие трихомонад у всех пациентов. Но под влиянием иммунитета и сопутствующей микрофлоры они была преимущественно в цистоподобной форме — в виде овальных ядер, нередко трихомонады были вакуолизированы и полуразрушены. То же наблюдалось и в клеточных культурах: трихомонады, перевиваемые и опухолевые клетки не гибли в питательной среде для культуральной диагностики трихомонад, в том числе под воздействием пищеварительного фермента трипсина и летальных доз облучения рентгеновскими лучами, но они погибали под воздействием сопутствующей микрофлоры. Другими словами, простейшие уступали своим биологическим соперникам в конкурентной борьбе за жизненное пространство. (Историческим аналогом этому служит пример подавления трихомонад агрессивными микробами в организмах людей, живших до начала прошлого века. Они редко болели раком, зато часто погибали от эпидемий чумы, холеры, черной оспы, от тифа и туберкулеза. Однако когда было покончено с этими болезнями, вскоре заявила о себе трихомонада: вначале в виде ротового, кишечного и вагинального трихомоноза, а затем — рака, сердечно-сосудистых и прочих патологий. — Т. Я. С.)

6. Проведенные исследования периферической крови из безымянного пальца руки и венозной — из локтевой вены людей разного возраста показали, что все они инвазированы трихомонадой во всех трех стадиях существования: были обнаружены цистоподобные, амебовидные и жгутиковые формы, а также делящиеся почкованием или отшнуриванием от «пуповин» — тонких перемычек, соединяющих дочерние клетки с материнскими.

7. Микроскопический анализ окрашенных по Романовскому препаратов отпечатков важнейших органов животных: сердца, мозга, легкого, печени, селезенки, почки и кишечника — показал наличие трихомонад во всех этих органах.

8. Внимательный анализ препаратов крови еще раз подтвердил заключения, ранее сделанные Свищёвой:

- тромбоциты — это отшнуровавшиеся от трихомонад (или возникшие в результате их грануляции) дочерние клеточки, активно атакующие и расплавляющие своими токсинами эритроциты;

- макрофаги — это гигантские, агрессивные трихомонады в амебовидной стадии существования, они атакуют лейкоциты и разрушают эритроциты. При гибели они не подвергаются аутолизу, как нормальные клетки, а распадаются на множество частичек; в крови их гематологи обозначили как тромбоциты. Все это наводит на мысль о бессмертии трихомонад, которым может противостоять только интеллект человека.

ВЫВОДЫ

1. Эксперимент в соответствии с планом научно-экспериментальной работы не был выполнен из-за невозможности получить не контаминированные микрофлорой клеточные культуры, питательные среды и сыворотки крови.

2. Наряду с выполнением вышеописанных экспериментов параллельно проводились многочисленные обследования людей на трихомонаду. Они показали, что все обследованные люди являются трихомонадоносителями, но в разной степени инвазированности.

3. Макрофаги по морфологии и злокачественности сходны с амебовидными трихомонадами. Тромбоциты крови, или кровяные пластинки, сходны с теми гранулами, которые образуются при распаде трихомонад на мелкие частицы. Тромбоциты тоже агрессивны и способны лизировать эритроциты. Все это требует дальнейшего изучения с паразитарных позиций.

4. Необходимо продолжить исследования в соответствии с планом данной научно-экспериментальной работы.