Эксперименты. Эксперименты? Эксперименты!

Разоблачение опухолевой клетки

Как и многим из нас, мне были известны всего два «раковых постулата»: опухолевые клетки есть у всех и раку предшествует длительная, незаметная для человека стадия предрака. Возник главный вопрос: что же такое опухолевая клетка? Первое ознакомление с литературой по онкологии показало: ученые всего мира считают, что клетки человека способны под влиянием различных факторов трансформироваться в опухолевые и вызывать онкологическое заболевание. Не имея медицинского образования и не находясь под влиянием онкологических догм, я не поверила, что мои клетки способны превращаться в раковые. И тогда вновь передо мною встал сакраментальный вопрос: что же такое опухолевая клетка?

Размышления оказались небесплодными. Я предположила, что на роль опухолевой клетки может претендовать одноклеточный паразит, вызывающий широко распространенное заболевание, протекающее длительно, незаметно и безболезненно для человека. Вполне возможно, что эта болезнь может оказаться предраком. А наглядная агитация в гинекологической клинике подсказала, что таким паразитом может быть... трихомонада. Идея на первый взгляд показалась абсурдной потому, что, как и все, я знала только о существовании вагинальной трихомонады - возбудителе полового трихомоноза. Но при чем здесь опухоли «благородных» органов: мозга, печени, легких? Ответ на этот и множество других вопросов дал грандиозный научно-литературный поиск, который я провела в ведущих библиотеках Москвы, Санкт-Петербурга, Новосибирска и Красноярска. А научные эксперименты, проведенные в лабораториях ведущих институтов Санкт-Петербурга: НИИ онкологии имени Н.Н.Петрова, НИИ акушерства и гинекологии имени Д.О.Отта, НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера и ЦНИ рентгенорадиологическом институте, подтвердили правильность моего предположения, ставшего открытием. А последующие исследования показали, как сильно ошибаются медики, которые искусственно ограничили статус трихомонады лишь ролью возбудителя пресловутого трихомоноза, который фактически является начальной бессимптомной стадией предрака.

«Разоблачить», то есть раскрыть истинную природу опухолевой клетки, можно лишь с помощью научных экспериментов. Первые из них были проведены в Санкт-Петербургском НИИ акушерства и гинекологии имени Д.О.Отта в 1990-91 гг.

В экспериментах использовались следующие опухолевые клетки и трихомонады. В НИ онкологическом институте имени Петрова непосредственно от усыпленных животных были перенесены в пробирки с питательной средой:

• - перевитые асцитные опухоли от белых беспородных мышей;
• - перевитая экспериментальная меланома Б-16 от линейной черной мыши C57Blgg;
• - солидная опухоль молочной железы, индуцированная γ - облучением дозой 4 Гр, от белой крысы.

В институте цитологии РАН были получены монослои музейных штаммов:

• - эпителоидная карцинома шейки матки HeLa S3;
• - овариальная тератокарцинома человека Ра-1;
• - тестикулярная тератокарцинома мыши F-9.

Из ЦНИ кожно-венерологического института г.Москвы в НИИ акушерства и гинекологии имени Отта, где проводились исследования, были привезены две пробирки с лабораторными штаммами вагинальных трихомонад от двух женщин.

В экспериментах также использовались:

• - вагинальная трихомонада от больных женщин из городского кожно-венерологического диспансера Санкт-Петербурга;
• - содержимое слепой кишки от произвольно взятой безопухолевой белой беспородной мыши;
• - соскоб с кишечника белой беспородной мыши;
• - помет от безопухолевых белых беспородных мышей.

Для опухолевых клеток и трихомонад создавались идентичные условия: работа велась не с монослоем, а с суспензией клеток, помещенных в конические пробирки и бюретки. Для инкубации клеток использовались питательные среды для трихомонад с добавлением агар-агара и дрожжевого экстракта.

Исследования на клеточном уровне

В современной науке наибольшее признание получили генетические исследования. Но для бесполых организмов наиболее эффективный и мощный метод генетических исследований - метод гибридизации - оказался невозможным. Вместо него используется анализ фенотипов. В данных экспериментах использовались два основных метода фенотипического анализа:

• 1) метод индукции физическими и химическими воздействиями, как наиболее эффективный источник наследственных вариаций исследуемых клеток;
• 2) метод сравнительных морфофизиологических исследований при одинаковых условиях культивирования опухолевых клеток и трихомонад, имеющих независимое происхождение.

Трихомонады - бесполые животные-клетки, в них сочетаются клетка и организм, особь и вид. А так как для агамно (бесполо) размножающихся простейших вид, прежде всего, выражается морфофизиологическими признаками, то при проведении эксперимента ставилась следующая задача: воздействием физическими и химическими факторами (летальными для нормальных клеток) выявить наследственные вариации опухолевых клеток, то есть сделать узнаваемыми путем перевода их в амебовидные и жгутиковые формы;

Сравнительный анализ морфофизиологических характеристик опухолевых клеток и трихомонад показал:

• а) опухолевые клетки и трихомонады не гибнут при минусовой температуре и перепадах температур более 30°С;
• б) при обработке трипсином все исследуемые клетки не переварились — это свидетельствует о том, что они - живые микроорганизмы (Д.Нортроп утверждал: «Трипсин не проникает в живую клетку, не атакует ее поверхность, так как предполагается небелковая природа поверхности клеток»);
• в) в процессе культивирования в виде суспензий в питательной среде для трихомонад и особенно после облучения клеточных культур наблюдалось их морфологическое изменение: исходные опухолевые клетки и цистоподобные трихомонады имели размеры 3-6 микрон, но с переходом в другие формы протоплазма их разуплотнялась, и они достигли величины 25-35 микрон у амебовидных и 15-18 микрон - у жгутиковых;
• г) способы размножения опухолевых клеток и трихомонад были идентичными, но отличались от размножения нормальных клеток, для которых характерен только митоз, начинающийся с распределения 23 пар хромосом на две равноценные части и деления ядра на две половинки.

В эксперименте наблюдалось (см. таблицу 2):

• - продольное деление цистоподобных клеток на две особи (простая перешнуровка), без заметной разницы между материнской и дочерней особями;
• - почкование: отделение от материнской клетки одной или нескольких особей гораздо меньшей величины, нередко они держались на тонких «пуповинах»;
• - шизогония: образование 4-х ядерных цитоподобных клеток, окруженных общей мембраной.

Легко сказать: родилась трихомонадная теория возбудителя рака. Это было как осенение, неожиданное прозрение. Мне предстояло отстоять эту теорию, доказать ее право на существование. И это было сделано в ведущих институтах Санкт-Петербурга.

Обычно при культивировании опухолевых клеток онкологи создают им условия, как для нормальных, и получают монослои ромбических или полигональных клеток, над которыми нередко плавают круглые клетки — одиночные и в виде колоний. Эти среды обычно содержат только витамины, минеральные вещества и аминокислоты. Я называю это «вегетарианской» пищей.

Исходя из того, что опухолевые клетки — это одноклеточные животные, то есть трихомонады, я поместила их в «жирную» среду для трихомонад, содержащую печеночный экстракт, пептон, дрожжевой экстракт, минеральные вещества, стероидный гормон фолликулин, мальтозу и другие факторы роста для трихомонад, хотя д.м.н. профессор М.А.Башмакова — заведующая лабораторией микробиологии НИИ акушерства и гинекологии, в которой проводились эти эксперименты, меня предупреждала: «Опухолевые клетки погибнут». Однако этот способ культивирования содействовал выявлению наследственных вариаций так называемых опухолевых клеток, которые на самом деле оказались цистоподобной формой трихомонад. В процессе пассирования некоторые из клеток постепенно переходили в узнаваемые амебовидные и жгутиковые формы, присущие трихомонадам. Как видно из таблицы 3, переход этот сопровождался изменением морфологии и размеров клеток в следующей последовательности:

• - в начальной стадии происходило разуплотнение цистоподобных округлых и овальных безъядерных клеток, имевших размеры 3-6 микрон, при этом площадь плотных участков уменьшалась, а размеры клеток увеличивались за счет разуплотнения протоплазмы;
• - затем в некоторых клетках появились зерна хроматина;
• - в процессе дальнейшего культивирования с пересевами, при которых добавлялась свежая питательная среда, формировались небольшие продолговатые ядра, часто смещенные от центра клетки;
• - под воздействием трипсина, который не разрушил опухолевые клетки, но переварил на их рецепторах белковые антитела, заставившие в свое время перейти трихомонад в клеточную форму, а также после радиационного облучения появились крупные амебовидные клетки размером до 25-35 микрон. Даже при большом полиморфизме видно определенное сходство между исследуемыми клетками. Опухолевые клетки и трихомонады были: ядерными, безъядерными, с зернами хроматина при наличии и отсутствии ядра, с ядром и ядрышком, с двумя ядрами и даже в виде четырех округлых клеток, окруженных общей мембраной и готовой к шизогонии, - распаду на четыре дочерние клетки;
• - в процессе дальнейшего культивирования наблюдался переход отдельных клеток в жгутиковую форму, размеры клеток уменьшались до 15 -18 микрон за счет сгущения цитоплазмы и образования органоидов. Клетки зафиксированы на разных стадиях развития вегетативной формы, они также отличались большим разнообразием форм;
• - при длительной задержке с пересевами клеток, в результате чего происходило накопление в среде токсических веществ обмена, вначале наблюдалось образование гигантских клеток, затем гибель амебовидных форм опухолевых клеток и трихомонад путем грануляции и разрушения их

на мелкие круглые частицы типа зерен при одновременном сохранении округлых цистоподобных форм, но по размерам меньших тех клеток, с которыми начинали эксперимент.

Таким образом, уже первые эксперименты, проведенные на клеточном уровне, показали идентичность опухолевых клеток и трихомонад. Здесь было показано не только их морфологическое сходство, но и одинаковость размножения и гибели.

Все это является прямым доказательством того, что трихомонады и опухолевые клетки имеют одну природу. Другими словами, так называемые опухолевые клетки - это не узнанные онкологами трихомонады, перешедшие в цистоподобную форму под влиянием иммунитета человека, сопутствующей микрофлоры и других факторов.

Исследования на генетическом уровне

Бесполое размножение простейших предполагает не только клеточный полиморфизм, но и полигеномность. Видообразование бесполых организмов в основном основывается на генетической адаптации к меняющимся условиям. Методы молекулярной гибридизации близких видов жгутиконосцев показали большие различия в последовательностях оснований ДНК. Что касается опухолевых клеток, известно, что они имеют разные наборы хромосом даже в одной опухоли. А это навело меня на мысль и о полиморфизме геномов, состоящих из различных наборов хромосом. У нормальных клеток человека, обязательно имеющих по 23 пары хромосом, есть общий, то есть характеризованный геном, по которому можно определить и вид клеток и отличить его от характеризованных геномов клеток других представителей животного мира. Казалось бы, и у трансформированных клеток должна быть такая же картина, поскольку они считаются человеческими клетками, но исследования показали обратное.

Для начала вспомним, что такое ген, ДНК, хромосома и геном. Вся наследственная информация о человеке записана в генах. Ген - это единица структурной и функциональной наследственности, представляющая собой отрезок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Ген - часть хромосомы, каждый ген занимает строго определенное место в соответствующей хромосоме. Ген сложен (он содержит 1000-1500 нуклеотидов, что соответствует 0,0003-0,0005 мм), но как единица наследственной информации остается функционально неделимым.

Хромосомы, материальным субстратом которых является хроматин, - это главные структурно-функциональные элементы клеточного ядра, содержащие в линейном порядке гены и обеспечивающие хранение, воспроизводство генетической информации, а также начальные этапы ее реализации в признаки. В клетках тканей многоклеточных организмов хромосомы парны, так как происходят от двух родительских. Этим они отличаются от половых клеток, содержащих по одинарному набору хромосом. В интерфазе, то есть в период между делением, клетки хромосомы максимально деконденсированы, индивидуально не различимы и занимают весь объем ядра, образуя хроматин.

Спаренность хромосом позволяет при делении клеток митозом передавать вместе с одним из двух наборов хромосом всю наследственную информацию от родительской клетки дочерней, то есть воспроизводить себе подобную. А так как этот набор хромосом, то есть геном, в нормальных клетках постоянен, следовательно, нормальные клетки имеют характерный для них геном - характеризованный геном. По-другому обстоит дело у опухолевых клеток и трихомонад, которые делятся обычно не митозом; для них характерны разнообразные способы размножения: промитоз (упрощенный митоз), почкование, шизогония, когда из одной клетки образуется несколько дочерних. Естественно, когда от материнской клетки отшнуриваются несколько разновеличинных клеток, то с ними уходит и разное количество хроматина, из которого впоследствии может сформироваться и различное количество хромосом. И эти наборы хромосом, то есть геномы, будут отличаться друг от друга. Отсюда можно сделать теоретический вывод: опухолевые клетки и трихомонады не имеют характеризованного генома, что является косвенным подтверждением их сходства между собой и отличия от нормальных клеток.

Для того чтобы это теоретическое утверждение подтвердить экспериментально, в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера были проведены исследования. Для получения характеризованных геномов опухолевых клеток и трихомонад был использован метод полимеразной цепной реакции. Анализ фотоснимков амплифицированных последовательностей в геномах исследуемых клеток показал мажорный полиморфизм, как внутриштаммовый, так и межштаммовый. Другими словами, между собой отличались не только трихомонады и опухолевые клетки, отобранные от разных людей и животных, но и пробы, взятые из одних и тех же пробирок с клеточными культурами. Наряду с этим отмечено сходство отдельных участков геномов карциномы шейки матки HeLa и вагинальной трихомонады от одной из женщин, а также участков генома опухоли молочной железы крысы и вагинальной трихомонады от другой женщины. И только в одном случае из трех проб вагинальных трихомонад от одной из женщин в двух пробах была получена идентичная последовательность генов. Отсюда вывод: в отличие от нормальных клеток трихомонады и опухолевые клетки не имеют характеризованного генома - в этом проявляется их сходство между собой и отличие от нормальных клеток. Более того, этот эксперимент показал, что генетические методы для опухолевых клеток неприемлемы. А так как онкология в настоящее время в основном опирается на них, это и послужило одной из причин, почему она не узнала в опухолевых клетках трихомонады, но не смогла объяснить и полигеномность и полихромосомность опухолевых клеток.

Исследования на молекулярном уровне

Для идентификации опухолевых клеток и трихомонад определенный интерес представляет так же сравнение нуклеотидного состава клеток - типов ДНК. Известно, что свободноживущие жгутиконосцы, например, одножгутиковая эвглена зеленая (Фитофлагеллата), как более древние организмы, имеют ДНК в основном ГЦ-типа, а ДНК нормальных клеток человека - АТ-типа. Если опухолевые клетки трансформировались из нормальных, то их ДНК должен иметь АТ-тип, а жгутиконосец трихомонада — ГЦ-тип. В эксперименте исследовались опухолевые клетки овариальной тератокарциномы человека Ра-1, рака молочной железы крысы и вагинальная трихомонада женщины.

Определение нуклеотидного состава исследуемых клеток проводилось на спектрофлуориметре «Hitachi-850». Сравнительный анализ результатов эксперимента показал, что содержание ДНК ГЦ-типа у трихомонад колеблется в пределах 38-64%, а в опухолевых клетках - в пределах 28-52%. Коэффициент сходства опухолевых клеток и трихомонад по содержанию ДНК ГЦ-типа составил 74%. А в пробах клеточных культур, содержащих равную концентрацию и достаточное количество клеток, не образующих колоний, то есть обладающих лучшей проницаемостью для реактивов, процентное содержание ДНК ГЦ-типа было практически одинаковым: у трихомонад - 38% и 43% и у опухолевых клеток - 38%. Отсюда вывод: хотя сравнение типов ДНК является косвенным доказательством, но оно достаточно убедительно показывает: опухолевая клетка «роднее» трихомонаде, чем нормальной клетке. А сам факт большего содержания ДНК АТ-типа, чем ДНК ГЦ-типа, у паразитов объясняется ассимилированием человеческих аминокислот и условиями жизни, одинаковыми с нормальными клетками.

Цитологическому сравнительному анализу были подвергнуты фиксированные и окрашенные препараты: опухолевых клеток рака молочной железы крысы, асцитной опухоли мыши и вагинальной трихомонады человека.

Анализ показал, что в ядрах опухолевых клеток и цистоподобных трихомонад хромосомы в полном их значении, как в ядрах нормальных клеток, отсутствуют. Чаще обнаруживался хроматин в цитоплазме ядерных и протоплазме безъядерных клеток в виде глыбок и мелких зерен, видных при увеличении микроскопа в 1000 раз.

Этот эксперимент стал еще одним косвенным доказательством идентичности опухолевых клеток и трихомонад.

Итак, проведенные эксперименты на опухолевых клетках и трихомонадах человека и животных прямо и косвенно доказали достоверность трихомонадной природы рака, возбудителем которого является паразитический жгутиконосец трихомонада (Флагеллата).